Bacillus subtilis növekedésgátlási teszt, agardiffúziós módszerrel

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Tanszék, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék, Környezeti Mikrobiológia és Biotechnológia Kutatócsoport

Szervezet/Adatszolgáltató neveBudapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Tanszék, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék, Környezeti Mikrobiológia és Biotechnológia Kutatócsoport
Kapcsolattartó személy neve
Dr. Molnár Mónika, Dr. Feigl Viktória
Módszer neveBacillus subtilis növekedésgátlási teszt, agardiffúziós módszerrel
Módszer angol neve
Bacillus subtilis growth inhibition test, agardiffusion method
A fejlesztés fázisa
alkalmazott
Fejlesztési projekt neve, száma
OMFB, PHARE TDQM, ECO-CHEM RISK, No.1111
A módszer típusa
Laboratóriumi teszt: Akut toxicitás vizsgálata
Egyéb típus
Agardiffúziós teszt
Toxicitás teszteknél
Növekedés (tömeg, gyökérhossz, klorofill tartalom)
Egyéb teszt típusnál
kioltási zóna átmérője [mm]
Teszt végpontja
EC20 / EC50 (Effective Concentration)
Gátlási %
Egyéb végpont
gátlási, serkentési zóna
Alkalmazott fajok száma
Egy fajt alkalmazó teszt
Tesztorganizmus
Baktérium
Expozíciós szcenárió
Levegő jellemzése
Teszt időtartama
Rövid idejű = akut
Reprodukálhatóság (%)
60.00
Szórás (%)
20.00
Szelektivitás
Nem szelektív
Szennyezőanyagcsoport|Konkrét szennyezőanyag
  • Fémek, félfémek és vegyületeik
  • kadmium
Alsó határ
15.00 mg/kg
Felső határ
5 000.00 mg/kg
Reprodukálhatóság (%)
60.00
Szórás (%)
20.00
Szelektivitás
Nem szelektív
Szennyezőanyagcsoport|Konkrét szennyezőanyag
  • Fémek, félfémek és vegyületeik
  • cink
Alsó határ
130.00 mg/kg
Felső határ
3 200.00 mg/kg
Reprodukálhatóság (%)
60.00
Szórás (%)
20.00
Szelektivitás
Nem szelektív
Szennyezőanyagcsoport|Konkrét szennyezőanyag
  • Fémek, félfémek és vegyületeik
  • réz
Alsó határ
200.00 mg/kg
Felső határ
4 000.00 mg/kg
A kivitelezéshez szükséges eszköz/műszer
steril fülke (lamináris box), termosztát, autokláv
Egyéb szükséges berendezés/segédeszköz
általános mikrobiológiai laboratóriumi eszközök (Petri csésze, lombik, pipetta, mérleg, üvegtálca tetővel)
Milyen standard anyagok szükségesek a kivitelezéshez
standard fém hígítási sor
Milyen reagensek/segédanyagok szükségesek a kivitelezéshez
húslé agar
Mennyi mintát igényel
1-5 g talaj, 1-5 ml vízminta
Hány alkalmazásra képes egy ember, egy munkanap alatt, egy készülékkel
500
Milyen szintű az adatfeldolgozás
Az adatok bevitele személyi számítógépbe, kiértékelés excel vagy más szoftver segítségével
Legalább milyen szakképzettség szükséges a kivitelezéshez
Középfokú (vegyésztechnikus, vegyipari szakmunkás, laboratóriumi asszisztens)
Milyen laboratórium szükséges a kivitelezéshez
Mikrobiológiai laboratórium
A berendezés beszerzési ára
1.000.000 - 2.000.000 HUF
Munkaerőköltség/mérés
0 - 500 HUF
Összes költség/mérés
500 - 1 000 HUF
Rövid lényegretörő leírás, az újdonság magyarázatával

Egy fajt alkalmazó, laboratóriumi bakteriálistoxicitási teszt, fémszennyezettség felmérésére fejlesztettük ki. A Bacillus subtilis toxikus fémekre mérsékelten érzékeny talajbaktérium.
A környezeti mintából (talaj, talajvíz, pórusvíz, üledék, hulladék, stb.) agar-agarral szilárdított mintakorongot készítünk, és ezt helyezzük a tesztorganizmust tartalmazó tápagar felületére. A szennyezőanyag a mintakorongból az agarlemezbe diffundál és mennyisége és toxicitása függvényében gátolja a mikrobaszaporodását. A mintakorong körül kialakult, kisebb denzitású, un. kioltási zóna mutataj a gátlást.

A módszer tipikus (javasolt) alkalmazásai

Szennyezett területek felmérése során elővizsgálatra, a negatív minták kiszűrésére javasolt, gyors ökotoxikológia teszt.
A teszt toxikus fémekkel (Cd, Cu, Zn) szennyezett folyadék- és szilárd-fázisú minták vizsgálatára is alkalmas.

A módszer korlátai

Standard oldatsor esetén a kioltási zóna átmérője arányos a szennyezőanyag koncentrációjával, így a zóna átmérőjéből következtethetünk a szennyezőanyag mennyiségére.
Talajminták esetén vegyi anyagok keverékével álluk szemben, amelyek agarban jellemző viselkedését a talajalkotók is jelentősen befolyásolják. A szennyezőanyagok legkülönbözőbb kémiai formáinak oldhatósága és diffúziója eltérő. Ezért szilárdfázisú minták esetén a kioltási zóna átmérője és a minta toxicitása közötti viszony nem mindig kvantitatív, viszont jól mutataja az aktuális toxicitást.

Van-e protokoll
igen
Részletes protokoll

A Bacillus subtilis törzset 24 órán át, 28 oC-on, rázatás közben szaporítjuk 20 ml húslé tápoldatban (inokulum).
A kísérleteket 30x30 cm-es steril üvegtálcában végezzük, melybe 100 ml 50 oC-os húslé agarhoz kevert 20 ml inokulumot öntünk. Az egyenletes tápagar vastagság érdekében vigyázni kell, hogy a tápagar megszilárdulása teljesen vízszintes felületen történjen.
Az érzékenységi vizsgálatokhoz a mintakorong készítése a következők szerint történik: 3,5 cm átmérőjű edénykébe 0,2 ml standard oldatot és 2 ml megolvasztott vizes agar keverékét öntünk, majd megszilárdulás után 13 mm átmérőjű dugófúróval vágjuk ki a mintakorongot. Talajminták esetén 2 ml megolvasztott vizes agar-agarhoz 1 g talajt keverünk, megszilárdulás után hasonlóan járunk el, mint a standard oldatok készítése esetén.
Az elkészített mintakorongokat az agar megszilárdulása után a tápagar felületére helyezzük.
A mintakorongokat hordozó agarlemezeket 30 oC-on inkubáljuk, 24 óra elteltével értékeljük a kísérleteket. Az értékeléskor a mintakorong körül kialakult zónát méretével és jellegével (gátlási, serkentési) jellemezzük. Gyengítési zóna gyakran több gyűrűre osztható, értékeléshez mindig a legkülső gyűrű átmérőjét használjuk.

Költség
5-nagyon kicsi
Időigény
4-kicsi
Munkaigény
4-kicsi
Felszerelés, műszerigény
4-kicsi
Szakember-igény
3-közepes
Környezeti és munkahelyi kockázatok
5-nagyon kicsi
Környezeti realitás
3-közepes
Igényeknek megfelelő pontosság
3-közepes
Reprodukálhatóság
4-jó
Költséghatékonyság
4-jó
Alkalmazhatóság
3-közepes
Elérhetőség
3-közepes
Ismertség
2-gyenge
Erősségek

Könnyen, gyorsan kivitelezhető, olcsó ökotoxikológiai eljárás.
Műszer- és eszközigénye kicsi.
Folyadék- és szilárdfázisú minták vizsgálatára egyaránt alkalmazható.
Elővizsgálatra, szűrővizsgálatra alkalmas, gyors ökotoxikológiai teszt. Egy nap alatt akár 500 minta vizsgálata is elvégezhető.

Gyengeségek

Talajminták esetén, általában nem egyedülálló szennyezőanyaggal állunk szemben, hanem vegyi anyagok keverékével, amelyek agarban jellemző viselkedését a talajalkotók maguk is jelentősen megváltoztathatják. Másrészről, a szennyezőanyagok a legkülönbözőbb kémiai formában lehetnek jelen, amelyeknek oldhatósága és diffúziója igen eltérő. Ezért szilárdfázisú minták esetén a kisebb denzitású zóna átmérője és a minta toxicitása közötti viszonyról kvantitatív következtetéseket csak nagy körültekintéssel lehet levonni. Így teljes talajminták esetén, a módszer kvalitatív természetű (toxikus, nem toxikus) eredményeket szolgáltat.

Lehetőségek

A módszer nagy kiterjedésű diffúzan szennyezett területek előzetes felmérése során kifejezetten hasznos lehet, a negatív minták kiszűrésére.

Veszélyek

A módszernek nincsenek jelentős veszélyei.
Az eredmények megfelelő értékelése, interpretációja nagy körültekintést igényel.

Lényeges szempontok, érdekességek, saját megjegyzések

A Gyöngyösorosziban található Pb-Zn bánya okozta környezeti károk felmérésére fejlesztettük ki ezt a laboratóriumi ökotoxikológiai tesztet. A korábban izolált és törzsgyűjteményünkben tárolt nehézfém-érzékeny törzseket a Gyöngyösoroszi meddőhányóról származó, a vizsgált területre jellemző toxikus fémtartalmú hulladékra való érzékenység szerint szelektáltuk.

Honlap referenciák és DEMO beszámolók
Publikációk

1.) Gruiz, K., Horváth, B. és Molnár, M. (2001) Környezettoxikológia, Vegyi anyagok hatása az ökoszisztémára, Műegyetemi Kiadó, Budapest

2.)Horváth, B. and Gruiz, K. (1996) Impact of Metalloferrous Ore Mining in Gyöngyösoroszi, Hungary. A Case Study. Science for the Total Environment, 184 p. 215–227

Alkalmazás helye, ország
Magyarország
Alkalmazás helye, város
Budapest
Alkalmazás éve
1996
Alkalmazási terület
Szennyezőanyag jellemzése környezeti elemben/ fázisban/ mintában
Talaj és a szennyezőanyag kölcsönhatásának jellemzése
Környezeti probléma, amelyre a módszert alkalmazták (régi)
Szennyezett terület felmérése: Szűrővizsgálat
Környezeti szcenárió, amelyre a módszert alkalmazták
Szárazföldi élőhely: szennyezett talaj
A környezeti elem/fázis, amelyre a módszert alkalmazták
Telítetlen talaj (direkt kontakt/teljes talaj)
Az alkalmazás tanulságai

Gyöngyösoroszi területén található Pb-Zn bánya toxikus fémekkel szennyezett területének felmérése során alkalmaztuk a módszert.
Az eljárás kiválónak bizonyult negatív minták kiszűrésére, így nagy kiterjedésű diffúzan szennyezett területek előzetes felmérésénél alkalmazása kifejezetten javasolt.

Adatlap azonosító (eredeti)
359
Bevivő
Molnár Mónika
Státusz
Publikált
Adatlap típusaBiológiai, ökotoxikológiai felmérési és monitoring módszerek
Létrehozás
Módosítás