Talaj dehidrogenáz enzimaktivitásának kvantitatív mérése

Budapest University of Technology and Economics, Department of Applied Biotechnology and Food Science, Environmental Microbiology and Biotechnology Group

Organisation/Data provider's nameBudapest University of Technology and Economics, Department of Applied Biotechnology and Food Science, Environmental Microbiology and Biotechnology Group
Name of contact
Dr. Molnár Mónika, Dr. Feigl Viktória
Telephone/fax
+36-1-4632347
Method Hungarian nameTalaj dehidrogenáz enzimaktivitásának kvantitatív mérése
Method name
Quantitative determination of dehydrogenase enzyme activity in soil
Stage of development
after application
Method type
other
Other type
Enzimaktivitás talajban
Toxicity tests
respiration: O2 consumption, CO2 production, enzime activity, ATP production
Other test types
dehidrogenáz enzim aktivitása
Endpoint of the test
ED20 / ED50 (Effective Dose)
LD20 / LD50 (Lethal Dose)
NOEC / NOEL No Observed Effects Concentration / Level
%
Other
Number of used species
multi species test
Number of other species
Talajmikroorganizmusok
Test organisms
Soil microflora
Exposition scenario
Terrestial habitat: polluted soil
Duration of the test
short term = acute
Reproducibility (%)
70.00
Deviation (%)
20.00
Selectivity
non-selective
Contaminant group|Typical contaminant
  • Chlorophenols
  • 4-monochlorophenol
Lower limit
10.00 mg/kg
Upper limit
1 000.00 mg/kg
Reproducibility (%)
80.00
Deviation (%)
20.00
Selectivity
non-selective
Contaminant group|Typical contaminant
  • Petroleum derivatives (TPH)
  • diesel oil
Lower limit
1 000.00 mg/kg
Upper limit
30 000.00 mg/kg
Reproducibility (%)
70.00
Deviation (%)
20.00
Selectivity
non-selective
Contaminant group|Typical contaminant
  • Petroleum derivatives (TPH)
  • other oil derivative
Lower limit
1 000.00 mg/kg
Upper limit
30 000.00 mg/kg
Instrument/equipment needed to perform the measurement
steril fülke (lamináris box), termosztát, autokláv, rázógép, spektrofotométer
Other necessary equipment/tools
általános mikrobiológiai laboratóriumi eszközök (normál lombik, Erlenmeyer lombik, pipetta, mérleg)
Standard materials for the test
trifenil-fromazán standard
Reagents/materials for the test
trifenil-tetrazólium-klorid, TRIS-HCl puffer, aceton
How many samples are needed
5-10 g talaj
How many tests can be performed simultaneously with one equipment
50
Data processing level
data input in PC, data evaluation by excel or other software
Necessary qualification
secondary education (chemical technician, chemical worker, laboratory assistant)
Type of laboratory for testing
microbiological laboratory
Estimated equipment cost
below 40 Euro
Labour cost/measurement
2 - 4 Euro
Total cost/measurement
20 - 40 Euro
Brief concise description explaining the innovation

A szerves anyagok aerob mikrobiális lebontása a biológiai membránokhoz kötött elektrontranszfer láncon keresztül történik. A légzési lánc valamelyik enzimének aktivitását megmérve információhoz juthatunk a sejt energiatermeléséről. Ez az alapja a dehidrogenáz enzimaktivitás mérésnek.
A dehidrogenáz enzimaktivitás méréshez trifenil-tetrazólium-klorid (TTC) mesterséges elektronakceptort használunk. A dehidrogenáz emzim a TTC-t trifenil-formazánná (TPF) redukálja. A reakció mértéke kolorimetriásan meghatározható.

Typical (recommended) application of the method

A talaj általános állapotának felmérése, biológiai aktivitás vizsgálata. Szennyezett talajok esetén a környezet spontán kialakult bontóképességének, biodegradációs potenciáljának bizonyítása és mértékének kimérése. Adaptációs folyamatok követése. Talajremediáció követése. Technológiai beavatkozások követése.

Limits of the method

A fény befolyásolja a színes termék képződését, zavaró hatású lehet. Ezért fénytől elzárva kell végezni a tesztet.

Is there any Protocol
yes
Detailed Protocol

A mérés menete:
Elkészítjük a reagenseket és a standard trifenil-formazán (TPF) koncentráció-sort (kalibrációs sor).
- Tris-HCl puffer: 12,1 g Tris (hidroximetil)-aminometánt feloldunk 700 ml desztillált vízben, majd sósavval beállítjuk a pH-t 7,4-re és desztillált vízzel kiegészítjük 1000 ml-re.
- Trifenil-tetrazólium-klorid (TTC) oldat: 80 ml Tris pufferben feloldunk 1,5 g talajt, majd kiegészítjük 100 ml-re ugyanazzal a pufferrel.
- TPF standard oldat: 50 mg TPF –t feloldunk 80 ml acetonban, majd acetonnal kiegészítjük 100 ml-re.
- TPF standard sor: a TPF standard oldatból 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 ml-t pipettázunk 50 ml-es mérőlombikokba, hozzáadunk 8,3 ml Tris puffert, majd acetonnal kiegészítjük 50 ml-re. A kalibrációs sor optikai denzitását megmérjük 546 nm-en, és elkészítjük a kalibrációs egyenest.
Ezt követően a nedves talajokból 5 g-ot, és a TTC oldatból 5 ml-t bemérünk egy-egy mérőedénybe, majd 24 órán keresztül 30 oC-on rázatjuk 100-150 rpm-el. A vak mintában csak 5 ml Tris van TTC nélkül. Az inkubáció után minden mintához 40 ml acetont adunk, majd tovább rázatjuk 2 órán át. Az aceton kioldja a keletkezett TPF-t. Ezután a talajszuszpenziót leszűrjük, és a tiszta szűrlet optikai denzitását mérjük 546 nm-en a vakkal szemben. A kapott abszorbancia értékek ismeretében a kalibrációs egyenesről leolvassuk a koncentrációkat, majd egységnyi talajdózisra megadjuk a a keletkezett TPF mennyiségét.

Costs
3-medium
Time requirement
4-low
Workload requirement
4-low
Equipment, apparata requirement
3-medium
Qualified labour
3-medium
Environmental risk and workplace risks
5-very low
Environmental reality
3-average
Adequate accuracy
3-average
Reproducibility
4-good
Cost efficiency
3-average
Feasibility
4-good
Availability
4-good
Well known
4-good
Strengths

A talaj biológiai aktivitását jól jellemző, rutinszerűen alkalmazható teszt.
A módszer több célra használható, így a szennyezett talaj saját aktivitása, nem szennyezett talaj válasza szennynezőanyagok különböző koncentációira, koncentrációsorára, beavatkozások hatásának mérése.

Weaknesses

A kvantitatív eredmény (dehidrogenáz aktivitás) mögött álló diverzitás-változások nem érzékelhetőek, illetve azok azonosítására kiegészítő mikrobiológiai vizsgálatok szükségesek.

Possibilities

Direkt kontakt toxicitási teszt fejleszthető belőle, ami azt jelenti, hogy talajszuszpenzió vagy zagy is tesztelhető.
Az eredmények interpretálására gátlási %, talajh koncentrációsorozat tesztelésével ED20 vagy ED50, NOEL vagy LOEL érték is kimérhető. Az így kapott talaj dózis értékek egy ismert szennyezőanyag-koncentrációval összehasonlítva koncentráció-egyenértékben is kifejezhetőek.

Threats

Az eredmények megfelelő értékelése, interpretációja körültekintést igényel.

Important findings, points of interest, remarks

Az itt ismertetett módszerrel rokon, de nem kvantitatív metodika magyar szabvány (MSZ-08-1721/3-86) szerint kivitelezett változatát a MOKKA adatbázis 179 sz. adatlapja ismerteti.

Publications

Molnár, M., Fenyvesi, É., Gruiz, K., Illés, G., Nagy, ZS., Hajdu, C. and Kánnai P. (2009) Laboratory testing of biodegradation in soil: a comparison of chemical and biological methods, In: Land Contamination & Reclamation (Eds. Gruiz, K. and Meggyes, T.), 17 (3–4), pp. 497–510, EPP Publications Limited, UK

Location of the application, country
Magyarország
Location of the application, town and/or region
Budapest
Year of application
2009
Application area
Contaminant characterisationin in environmental element/phase/sample
General characterisation of soil
Characterisation of the interaction between soil and pollutant
Environmental problem the method was applied to (old)
Environmental monitoring: During technology operation: biomonitoring and integrated monitoring to follow the emissions
Environmental scenario the method was applied to
Terrestial habitat: polluted soil
Environmental element/phase the method was applied to
unsaturated soil (direct contact)
Lessons learned

4-klórfenollal 10, 100 és 1000 ppm koncentrációkban szennyezett talajmikrokozmoszokban modelleztük a természetes szennyezőanyag-csökkenést (Natural Attenuation) és követtük a talajokban folyó biodegradációs folyamatokat.
A talaj dehidrogenáz enzimaktivitása jól mutatta a nagymértékben szennyezett (1000 ppm) talaj toxikus hatását a talaj mikroflórájára a szennyezést követően, valamint a kevésbé szennyezett talajokban a mikroflóra adaptálódását. Ugyanakkor a dehidrogenáz enzimaktivitás alakulása jól szemléltette a talajban zajló ellentétes irányú folyamatokat is: hozzáférhetőség-növekedés, mobilizáció és biodegradáció.

Datasheet id (original)
361
Creator
Molnár Mónika
Status
Verified
Adatlap típusaBiological, ecotoxicological assessment and monitoring methods
Létrehozás
Módosítás